鐵死亡（Ferroptosis）是一種鐵依賴性的程序性細胞死亡形式，以脂質(zhì)過氧化積累和氧化損傷為特征。其檢測需結合形態(tài)學、生化指標、分子標志物及功能學實驗，以下為系統(tǒng)化

的檢測策略：

一、形態(tài)學觀察

1.透射電鏡（TEM）

檢測指標：線粒體萎縮、嵴減少、膜密度增高，細胞膜完整但無典型凋亡小體。

步驟：固定（戊二醛/鋨酸）→脫水包埋→超薄切片→染色觀察。

優(yōu)點：直觀顯示結構變化。

缺點：設備要求高，操作復雜。

 

 

 

 

線粒體整體體積縮小，形態(tài)皺縮   基質(zhì)電子密度增高（因內(nèi)容物濃縮）或出現(xiàn)不均勻分布。

二、脂質(zhì)過氧化檢測

1.丙二醛（MDA）檢測

原理：硫代巴比妥酸（TBA）法，MDA與TBA生成紅色復合物。

方法：分光光度計（532nm）或熒光法（Ex/Em=515/553nm）。

試劑盒：如TBARSAssayKit。

2.C11BODIPY581/591探針

原理：脂質(zhì)過氧化將探針從紅色（591nm）轉(zhuǎn)為綠色（510nm）

方法：流式細胞術或熒光顯微鏡定量。

優(yōu)勢：實時、動態(tài)監(jiān)測。

3.4-HNE檢測

方法：ELISA或免疫熒光檢測4-羥基壬烯酸（4-HNE）修飾蛋白。

三、谷胱甘肽系統(tǒng)分析

1.GSH/GSSG比值

檢測：DTNB法（Ellman試劑）或熒光探針（如mBCl）。

意義：鐵死亡中GSH消耗，GSSG增加，比值下降。

2.GPX4活性與表達

活性檢測：NADPH消耗法（340nm吸光度下降）。

蛋白表達：Westernblot或免疫組化（GPX4抗體）。

四、鐵代謝相關檢測

1.細胞內(nèi)鐵水平

探針：PhenGreenSK（鐵淬滅熒光）或Calcein-AM。

方法：流式細胞術或熒光顯微鏡。

其他：普魯士藍染色（組織樣本）。

2.鐵蛋白（Ferritin）與鐵調(diào)蛋白

檢測：Westernblot（FTL/FTH）、qPCR（IREB2、TFRCmRNA）。

五、功能學驗證

1.抑制劑/誘導劑干預

抑制劑：Ferrostatin-1（1-10μM）、Liproxstatin-1（0.1-1μM）。

鐵螯合劑：DFO（10-100μM）、去鐵胺（DFOM）。

誘導劑：RSL3（GPX4抑制劑，0.1-1μM）、Erastin（SystemXc?抑制劑，10-50μM）。

驗證：預處理抑制劑后觀察細胞死亡緩解。

2.基因調(diào)控

敲低/過表達：shRNA/siRNA敲低GPX4、ACSL4或過表達SLC7A11。

六、分子標志物檢測

1.關鍵蛋白表達

上調(diào)：ACSL4、TFR1、NOX1。

下調(diào)：GPX4、SLC7A11、FSP1。

方法：Westernblot、免疫熒光。

七、多組學聯(lián)合分析

1.脂質(zhì)組學：靶向分析PUFA-PL（如PE-AA/AdA）氧化產(chǎn)物。

2.轉(zhuǎn)錄組學：篩選差異基因（如ATF4、CHAC1）。

3.代謝組學：檢測胱氨酸、谷胱甘肽代謝通路變化。

八、注意事項與對照設置

1.排除其他死亡方式：

凋亡：檢測Caspase-3活化、AnnexinV/PI雙染。

壞死：檢測LDH釋放、PI滲透性。

自噬：LC3-II/I比值、自噬抑制劑（如3-MA）。

2.對照設計：

陽性對照：RSL3/Erastin處理。

陰性對照：Ferrostatin-1聯(lián)合誘導劑。

空白對照：未處理細胞。

九、實驗優(yōu)化與挑戰(zhàn)

-細胞類型：不同細胞系對鐵死亡敏感性差異大（如HT-1080、肝癌細胞敏感）。

-時間點：脂質(zhì)過氧化通常在誘導后6-24小時達峰。

-交叉驗證：至少聯(lián)合3種方法（如MDA+C11BODIPY+GPX4WB）。

總結

鐵死亡檢測需多維度驗證，結合形態(tài)、生化、分子及功能學證據(jù)，并嚴格設置對照以排除混雜因素。實驗設計應針對研究模型優(yōu)化條件，確保結果特異性與可重復性。