鐵死亡（Ferroptosis）是一種鐵依賴性的程序性細(xì)胞死亡形式，以脂質(zhì)過(guò)氧化積累和氧化損傷為特征。其檢測(cè)需結(jié)合形態(tài)學(xué)、生化指標(biāo)、分子標(biāo)志物及功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，以下為系統(tǒng)化

的檢測(cè)策略：

一、形態(tài)學(xué)觀察

1.透射電鏡（TEM）

檢測(cè)指標(biāo)：線粒體萎縮、嵴減少、膜密度增高，細(xì)胞膜完整但無(wú)典型凋亡小體。

步驟：固定（戊二醛/鋨酸）→脫水包埋→超薄切片→染色觀察。

優(yōu)點(diǎn)：直觀顯示結(jié)構(gòu)變化。

缺點(diǎn)：設(shè)備要求高，操作復(fù)雜。

 

 

 

 

線粒體整體體積縮小，形態(tài)皺縮   基質(zhì)電子密度增高（因內(nèi)容物濃縮）或出現(xiàn)不均勻分布。

二、脂質(zhì)過(guò)氧化檢測(cè)

1.丙二醛（MDA）檢測(cè)

原理：硫代巴比妥酸（TBA）法，MDA與TBA生成紅色復(fù)合物。

方法：分光光度計(jì)（532nm）或熒光法（Ex/Em=515/553nm）。

試劑盒：如TBARSAssayKit。

2.C11BODIPY581/591探針

原理：脂質(zhì)過(guò)氧化將探針從紅色（591nm）轉(zhuǎn)為綠色（510nm）

方法：流式細(xì)胞術(shù)或熒光顯微鏡定量。

優(yōu)勢(shì)：實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。

3.4-HNE檢測(cè)

方法：ELISA或免疫熒光檢測(cè)4-羥基壬烯酸（4-HNE）修飾蛋白。

三、谷胱甘肽系統(tǒng)分析

1.GSH/GSSG比值

檢測(cè)：DTNB法（Ellman試劑）或熒光探針（如mBCl）。

意義：鐵死亡中GSH消耗，GSSG增加，比值下降。

2.GPX4活性與表達(dá)

活性檢測(cè)：NADPH消耗法（340nm吸光度下降）。

蛋白表達(dá)：Westernblot或免疫組化（GPX4抗體）。

四、鐵代謝相關(guān)檢測(cè)

1.細(xì)胞內(nèi)鐵水平

探針：PhenGreenSK（鐵淬滅熒光）或Calcein-AM。

方法：流式細(xì)胞術(shù)或熒光顯微鏡。

其他：普魯士藍(lán)染色（組織樣本）。

2.鐵蛋白（Ferritin）與鐵調(diào)蛋白

檢測(cè)：Westernblot（FTL/FTH）、qPCR（IREB2、TFRCmRNA）。

五、功能學(xué)驗(yàn)證

1.抑制劑/誘導(dǎo)劑干預(yù)

抑制劑：Ferrostatin-1（1-10μM）、Liproxstatin-1（0.1-1μM）。

鐵螯合劑：DFO（10-100μM）、去鐵胺（DFOM）。

誘導(dǎo)劑：RSL3（GPX4抑制劑，0.1-1μM）、Erastin（SystemXc?抑制劑，10-50μM）。

驗(yàn)證：預(yù)處理抑制劑后觀察細(xì)胞死亡緩解。

2.基因調(diào)控

敲低/過(guò)表達(dá)：shRNA/siRNA敲低GPX4、ACSL4或過(guò)表達(dá)SLC7A11。

六、分子標(biāo)志物檢測(cè)

1.關(guān)鍵蛋白表達(dá)

上調(diào)：ACSL4、TFR1、NOX1。

下調(diào)：GPX4、SLC7A11、FSP1。

方法：Westernblot、免疫熒光。

七、多組學(xué)聯(lián)合分析

1.脂質(zhì)組學(xué)：靶向分析PUFA-PL（如PE-AA/AdA）氧化產(chǎn)物。

2.轉(zhuǎn)錄組學(xué)：篩選差異基因（如ATF4、CHAC1）。

3.代謝組學(xué)：檢測(cè)胱氨酸、谷胱甘肽代謝通路變化。

八、注意事項(xiàng)與對(duì)照設(shè)置

1.排除其他死亡方式：

凋亡：檢測(cè)Caspase-3活化、AnnexinV/PI雙染。

壞死：檢測(cè)LDH釋放、PI滲透性。

自噬：LC3-II/I比值、自噬抑制劑（如3-MA）。

2.對(duì)照設(shè)計(jì)：

陽(yáng)性對(duì)照：RSL3/Erastin處理。

陰性對(duì)照：Ferrostatin-1聯(lián)合誘導(dǎo)劑。

空白對(duì)照：未處理細(xì)胞。

九、實(shí)驗(yàn)優(yōu)化與挑戰(zhàn)

-細(xì)胞類型：不同細(xì)胞系對(duì)鐵死亡敏感性差異大（如HT-1080、肝癌細(xì)胞敏感）。

-時(shí)間點(diǎn)：脂質(zhì)過(guò)氧化通常在誘導(dǎo)后6-24小時(shí)達(dá)峰。

-交叉驗(yàn)證：至少聯(lián)合3種方法（如MDA+C11BODIPY+GPX4WB）。

總結(jié)

鐵死亡檢測(cè)需多維度驗(yàn)證，結(jié)合形態(tài)、生化、分子及功能學(xué)證據(jù)，并嚴(yán)格設(shè)置對(duì)照以排除混雜因素。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)針對(duì)研究模型優(yōu)化條件，確保結(jié)果特異性與可重復(fù)性。