• FISH技術(shù)的基本原理及優(yōu)勢(shì)

熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)是近些年較為常用的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)、該技術(shù)通過已知的核苷酸片段與靶DNA形成靶DNA與核酸探針的雜交體，可直接在組織切片(冷凍切片或石蠟切片)、細(xì)胞涂片、染色體制備標(biāo)本或培養(yǎng)細(xì)胞爬片上雜交。該技術(shù)操作簡單、快速、直觀、靈敏度高，目前廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究及某些遺傳疾病和腫瘤的臨床診斷。

皮諾飛生物FISH實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)www.intechopen.com.cn，15392937510.

一、原理

FISH是以熒光素標(biāo)記已知序列的核苷酸片段(探針)與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測(cè)體系在顯微鏡下對(duì)待測(cè)DNA進(jìn)行定性、定量或相對(duì)定位分析。具有敏感、快速、能同時(shí)顯示多種顏色等優(yōu)點(diǎn)，不但能顯示中期核分裂象的染色體，還能檢測(cè)間期細(xì)胞核的DNA。

二、優(yōu)勢(shì)

自20世紀(jì)80年代末，Pinkel和Heiles將FISH技術(shù)引入染色體檢測(cè)領(lǐng)域后，F(xiàn)ISH技術(shù)就在臨床診斷及科研工作中得到了廣泛的運(yùn)用，顯示出與一些傳統(tǒng)技術(shù)相比的明顯優(yōu)勢(shì)。與傳統(tǒng)的免疫組織化學(xué)法(IHC)相比，F(xiàn)ISH技術(shù)具有良好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。此外，熒光原位雜交結(jié)果的判定借助于對(duì)熒光的顏色判斷和信號(hào)計(jì)數(shù)，客觀地量化了檢測(cè)結(jié)果。FISH的另一個(gè)特點(diǎn)是可以聯(lián)合應(yīng)用多種標(biāo)記系統(tǒng)，在一次雜交中可檢測(cè)多種探針在染色體上的位置及探針間的相互關(guān)系，即多色FISH或多靶FISH。與其他分子生物學(xué)檢測(cè)手段相比，F(xiàn)ISH可以在組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對(duì)完整的前提下，在癌細(xì)胞原位分析單細(xì)胞核內(nèi)基因的變化，同時(shí)又排除了其他非癌細(xì)胞的干擾，所以已廣泛應(yīng)用于腫瘤研究中的基因擴(kuò)增、易位重排及缺失等的檢測(cè)，在腫瘤診斷和鑒別診斷、預(yù)后和治療監(jiān)控等方面都有重要意義。

• 熒光原位雜交的實(shí)驗(yàn)操作

一、探針標(biāo)記

FISH探針一般采用隨機(jī)引物法或切口翻譯法，如將PCR技術(shù)引入FISH探針標(biāo)記，可使其靈敏度提高到0.25kb。應(yīng)用TSA系統(tǒng)(tyramidesignalamplification)能將雜交信號(hào)再放大1000倍，可用于單拷貝基因的定位。FISH分辨率大約為1~3Mb,如果應(yīng)用強(qiáng)變性劑處理染色體，讓DNA分子從蛋白質(zhì)中分離出來，使雙DNA完全伸展并黏附在玻片上，經(jīng)預(yù)處理后，分辨率可達(dá)1~2kb。還可采用對(duì)分裂中期染色體進(jìn)行顯微解剖(microdissect)法以提高分辨率。

探針的熒光素標(biāo)記可以采用直接和間接標(biāo)記的方法。間接標(biāo)記是采用生物素標(biāo)記DNA探針，雜交之后用耦聯(lián)有熒光素親和素或鏈霉親和素進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)利用親和素-生物素-熒光素復(fù)合物，將熒光信號(hào)放大，從而可以檢測(cè)500bP的片段。直接標(biāo)記法是將熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價(jià)結(jié)合，或在缺口平移法標(biāo)記探針時(shí)將熒光素核苷三磷酸摻入。

由于間接法的操作步驟較為繁瑣，所以目前直接法的使用更為廣泛。

二、實(shí)驗(yàn)相關(guān)設(shè)備

1.熒光原位雜交成像系統(tǒng),包括熒光顯微鏡及相應(yīng)的濾光片組、分析軟件。

2.42℃恒溫孵箱或雜交儀,立式染缸(考普林瓶)、計(jì)時(shí)器、水銀溫度計(jì)。

3.恒溫水浴箱、旋渦混合器、離心機(jī)、烤片機(jī)、移液器。

4.pH計(jì)或精密pH試紙、載玻片、蓋玻片、0.5ml離心管。

三、實(shí)驗(yàn)操作

熒光原位雜交技術(shù)總體上分為：預(yù)處理階段，變性雜交階段，玻片后洗階段，復(fù)染階段，鏡檢結(jié)果階段。檢測(cè)試劑盒應(yīng)該使用國家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)認(rèn)可的產(chǎn)品。

不同公司生產(chǎn)的探針試驗(yàn)方法略有不同，由于采用不同的探針試劑，診斷技術(shù)操作方法會(huì)有差異，所以本文以Her-2探針為例，講解其實(shí)驗(yàn)步驟，各實(shí)驗(yàn)室要開展熒光原位雜交技術(shù)應(yīng)結(jié)合說明書進(jìn)行操作，現(xiàn)介紹兩種操作方法：

(一)操作步驟(以金菩佳試劑盒為例)

1.組織預(yù)處理

(1)組織經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片4~5μm,置于防脫載玻片上。

(2)將組織切片置于65℃烤箱內(nèi)過夜。

(3)切片脫蠟至蒸餾水。

(4)30%酸性亞硫酸鈉(sodiumbisulfite)50℃處理組織切片20～30min;或用90℃去離子7理組織切片20~30min。

(5)室溫下于2×SSC溶液中漂洗2次，每次5min。若用90℃去離子水則省略此步驟。

(6)切片浸泡在蛋白酶K工作液(終濃度200μg/ml)中，37℃孵育5~30min。

(7)切片經(jīng)蛋白酶K消化后，于2×SSC溶液中漂洗2次，每次5min。

(8)室溫下將切片依次置于70%乙醇、85%乙醇和無水乙醇中各2min脫水。

(9)自然干燥切片。

2.變性雜交

(1)熒光原位雜交有雜交儀變性雜交和甲酰胺變性雜交兩種方法。前者是用雜交儀對(duì)樣本和探針進(jìn)行共變性，減少人為因素的影響；后者是樣本和探針分別進(jìn)行變性。

(2)雜交儀變性雜交(自動(dòng)操作):設(shè)置雜交儀器共變性條件：83℃5min,雜交條件：42℃,16~18h(不同公司探針請(qǐng)參考說明書)。

將探針(2.0μl)、雜交緩沖液(7.0μl)和去離子水(1.0μl)加入EP管(依據(jù)試劑說明書推薦使用),渦旋混勻后短暫離心1~3s,滴加于切片雜交區(qū)域，加蓋蓋玻片，用橡皮膠封邊，避免產(chǎn)生氣泡。放入雜交儀中雜交。

3.雜交后洗滌

(1)將切片置于室溫50%甲酰胺/2×SSC溶液中移去蓋玻片。

(2)將切片置于(46±1)℃50%甲酰胺/2×SSC溶液中，漂洗5min×3次。

(3)將切片置于(46±1)℃2×SSC溶液漂洗4min。

(4)將切片置于(46±1)℃0.1%NP-40/2×SSC中，漂洗5min。

(5)將切片置于2×SSC5s后迅速將其置于70%乙醇中，漂洗3min。

4.復(fù)染暗處自然干燥切片后，將15μlDAPI復(fù)染劑滴加于雜交區(qū)域，立即蓋上蓋玻片。放置10~20min后，在熒光顯微鏡下選用合適的濾光片組觀察切片。

(二)操作步驟二：

現(xiàn)介紹Abbott公司的PathvysionHer-2DNAProbeKit的操作方法，預(yù)處理的試劑盒為Abbott公司的VysisPareffinPretreatmentReagentkit。

1.組織雜交前處理

(1)組織經(jīng)10%中性福爾馬林固定包埋，切片4~5μm,置于防脫載玻片上烤片60℃過夜。

(2)切片脫蠟至蒸餾水。

(3)預(yù)處理液(pretreatmentsolusion)80℃處理切片10min后蒸餾水洗3min,室溫空氣中干燥2~5min。

(4)放入37℃水浴預(yù)熱的消化液(proteasebuffer+pepsion)中孵育10~60min后蒸餾水洗3min,室溫空氣中干燥2~5min。

(5)將切片梯度脫水，空氣中干燥。

2.變性雜交加適量探針于組織上蓋玻片封片，用橡皮膠封片放入雜交儀中雜交過夜。設(shè)置雜交儀器共變性條件：75℃5min,雜交條件：37℃,16~18h。

3.雜交后洗滌

(1)從雜交儀中取出昨日玻片，去掉封片膠。

(2)準(zhǔn)備兩缸washbuffer備用，在第一缸洗脫液(washbuffer)中去掉蓋玻片。

(3)74℃水浴預(yù)熱的第二缸洗脫液(washbuffer)中漂洗2min。

(4)空氣中干燥。

4.復(fù)染加適量DAPI復(fù)染劑于雜交區(qū)域，蓋上蓋玻片，置于熒光顯微鏡下觀察。

四、鏡檢結(jié)果

熒光顯微鏡觀察，通過專用軟件合成彩色圖像，攝影保存FISH結(jié)果，進(jìn)行結(jié)果判定(圖20-2-3~20-2-6):

隨機(jī)計(jì)數(shù)20個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)Ratio值(Ratio值=20個(gè)細(xì)胞核中紅信號(hào)總數(shù)/20個(gè)細(xì)胞核中綠色信號(hào)總數(shù)):

Ratio<1.8為陰性結(jié)果，提示樣本無Her-2基因擴(kuò)增。

Ratio>2.2為陽性結(jié)果，提示樣本存在Her-2基因擴(kuò)增。

Ratio介于1.8~2.2之間時(shí)為臨界值，可增加計(jì)數(shù)細(xì)胞至60～100個(gè)，或重做FISH實(shí)驗(yàn)來判斷最終結(jié)果。

計(jì)數(shù)細(xì)胞必須是各通道信號(hào)均清晰可辨的細(xì)胞，細(xì)胞核輪廓不清或有重疊的不要分析。

雜交不均勻的區(qū)域不要分析。

背景深影響信號(hào)判斷的區(qū)域不要分析。

在分析石蠟切片時(shí)，分析的區(qū)域應(yīng)在腫瘤細(xì)胞集中的部位(需由病理科醫(yī)師認(rèn)定)。

如果超過25%的細(xì)胞核內(nèi)信號(hào)太弱，則該區(qū)域不要進(jìn)行分析。

如果超過10%的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有信號(hào)，則該區(qū)域不要進(jìn)行分析。

FISH技術(shù)檢測(cè)HER2基因未見擴(kuò)增

FISH技術(shù)檢測(cè)HER2基因擴(kuò)增

FISH技術(shù)檢測(cè)17號(hào)染色體呈多休

性、HER2基因未見擴(kuò)增

FISH技術(shù)檢測(cè)17號(hào)染色體呈多休

性、HER2基因未見擴(kuò)增

五、FISH檢測(cè)操作注意事項(xiàng)

1.組織處理須標(biāo)準(zhǔn)化，應(yīng)盡可能縮短取材到固定的時(shí)間。在觀察完大體標(biāo)本特征后，將組織每隔5~10mm呈書頁狀切開充分固定，組織固定液為10%中性福爾馬林緩沖液，最佳固定時(shí)間6~48h。有的公司探針超過6周的石蠟切片不宜再用于Her-2檢測(cè)，有的公司探針對(duì)幾年或幾十年的蠟塊仍可用于Her-2檢測(cè)。

2.實(shí)驗(yàn)程序必須標(biāo)準(zhǔn)化。任何檢測(cè)結(jié)果的偏差均需報(bào)告，并重新進(jìn)行確認(rèn)調(diào)整。

3.實(shí)驗(yàn)室在每一輪檢測(cè)中均應(yīng)使用標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照材料(陽性、陰性)。

4.切片在后洗液中應(yīng)嚴(yán)格掌握溫度和時(shí)間，可降低背景。

5.雜交后的玻片應(yīng)注意避光，盡量不要暴露于日光燈和陽光下，存放于避光玻片盒內(nèi)。根據(jù)熒光染料的不同，選擇相應(yīng)的熒光顯微鏡濾色片。

6.熒光信號(hào)容易淬滅，染色后應(yīng)及時(shí)在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，同時(shí)攝影保存圖像。如果當(dāng)時(shí)不觀察，可將切片放入-20℃避光的盒內(nèi)保存，兩個(gè)月或更長時(shí)間仍可保持良好。

7.試劑不宜反復(fù)凍融。

8.探針使用前應(yīng)先混勻后離心，注意避光。

9.報(bào)告Her-2結(jié)果的醫(yī)生應(yīng)相對(duì)固定。

10.在乳腺癌Her-2結(jié)果判斷時(shí)，應(yīng)選擇浸潤性病變部位。

11.在進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)信號(hào)時(shí)，應(yīng)至少2個(gè)人隨機(jī)判讀腫瘤細(xì)胞信號(hào)，至少計(jì)數(shù)20個(gè)細(xì)胞。