服務(wù)介紹：

免疫熒光四標(biāo)即利用酪胺信號(hào)放大（TSA，Tyramide signal amplification）即TSA技術(shù)，在同一張切片上對(duì)四種蛋白同時(shí)進(jìn)行標(biāo)記，從而可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種蛋白空間定位，定性及半定量分析。

TSA技術(shù)主要原理為熒光標(biāo)記的酪胺在二抗上偶聯(lián)的HRP與H₂O₂的作用下變?yōu)榛罨睦野凡⒏街诎袠?biāo)周圍的蛋白酪氨酸殘基上，此結(jié)合是共價(jià)結(jié)合。而一抗與靶標(biāo)、二抗與一抗之間是非共價(jià)結(jié)合。通過(guò)抗體洗脫液處理，非共價(jià)結(jié)合的一抗二抗被洗脫掉，而共價(jià)結(jié)合的熒光酪胺依然附著在靶標(biāo)周圍，將靶標(biāo)通過(guò)熒光標(biāo)記顯示出來(lái)。在檢測(cè)第二個(gè)靶標(biāo)時(shí)，相當(dāng)于全新的一輪標(biāo)記，無(wú)需考慮第二輪的抗體是否與第一輪的抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng)。只需改變不同種類熒光染料標(biāo)記TSA即可實(shí)現(xiàn)多個(gè)靶標(biāo)的標(biāo)記。通過(guò)多次重復(fù)免疫標(biāo)記，使用不同的熒光酪胺實(shí)現(xiàn)雙重或多重熒光染色。

主要用途：

1、原位展示及定量分析雙重優(yōu)勢(shì)。

2、更全面的分析：藥物靶點(diǎn)和腫瘤微環(huán)境同時(shí)分析。

3、不同靶點(diǎn)自由組合，多靶標(biāo)共定位染色，也可拆分信號(hào)。

4、展示空間位置關(guān)系，區(qū)分不同細(xì)胞亞群。

檢測(cè)原理：

在過(guò)氧化氫存在時(shí)，一些酶如辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶等可以催化一種酪胺的底物為一種非?；钴S的短壽命中間體，在短時(shí)間內(nèi)，中間體可以共價(jià)結(jié)合到周圍蛋白的富電子表面形成酪胺化復(fù)合物，由于相接的蛋白（如HRP，抗體，目標(biāo)抗原）都含有大量的酪氨酸結(jié)合位點(diǎn)，因此會(huì)富集大量信號(hào)，使信號(hào)被有效放大。

結(jié)果展示：

免疫熒光四標(biāo)：EMCN紫+Osterix粉+Hif1α綠+CD31紅_股骨

實(shí)驗(yàn)流程：

抗原修復(fù)：暴露樣本中被掩蓋的抗原表位，便于后續(xù)抗體結(jié)合 ，常用加熱、酶解等方法。

滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：消除樣本自身過(guò)氧化物酶干擾，避免后續(xù)顯色時(shí)出現(xiàn)非特異性染色，常用過(guò)氧化氫處理。

血清封閉：用無(wú)關(guān)血清封閉樣本中非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少后續(xù)抗體非特異性結(jié)合，降低背景染色。

脫蠟至水：針對(duì)石蠟切片，通過(guò)二甲苯等脫蠟試劑去除石蠟，再經(jīng)梯度乙醇復(fù)水，使樣本適合后續(xù)水性試劑反應(yīng) 。

孵育二抗：二抗與一抗（特異性結(jié)合抗原的抗體 ）結(jié)合，起到橋梁作用，后續(xù)可通過(guò)標(biāo)記物（如熒光素、酶等 ）顯色或發(fā)光，常用孵育盒 37℃孵育。

洗脫：洗去未結(jié)合的二抗等試劑，保證染色特異性，常用緩沖液沖洗。

染核：對(duì)細(xì)胞核染色，方便定位觀察，如蘇木精染核呈藍(lán)色，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)更清晰。

標(biāo)記熒光素（若適用）：若為免疫熒光染色，熒光素標(biāo)記二抗或特定探針，激發(fā)光下發(fā)出熒光，用于熒光顯微鏡觀察。

封片：用封片劑將樣本封固在載玻片上，保護(hù)染色結(jié)果，便于長(zhǎng)期保存和鏡檢，常用中性樹(shù)膠等。

鏡檢：最后在顯微鏡下觀察染色結(jié)果，分析抗原分布、表達(dá)等情況，用于病理診斷、科研分析等 。 不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹颖绢愋?，流程?xì)節(jié)（如試劑、時(shí)間、溫度 ）會(huì)有調(diào)整。

嚴(yán)格的TSA法多色免疫熒光實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

1、IHC免疫組化預(yù)實(shí)驗(yàn) - 驗(yàn)證抗體 - 客戶確認(rèn)結(jié)果。

2、IF免疫熒光單標(biāo)預(yù)實(shí)驗(yàn)（TSA法） - 驗(yàn)證濃度及顏色搭配調(diào)整優(yōu)化 - 客戶確認(rèn)結(jié)果（表達(dá)豐度）。

3、IF免疫熒光多標(biāo)組合測(cè)試預(yù)實(shí)驗(yàn) - 標(biāo)記順序優(yōu)化確認(rèn)。

4、IF多標(biāo)正式實(shí)驗(yàn) - 小批量染色 - 客戶確認(rèn)結(jié)果。

5、IF多標(biāo)正式實(shí)驗(yàn) - 大批量染色 - 客戶確認(rèn)結(jié)果。

樣本要求及運(yùn)輸條件：

1、提供固定合格的樣本。組織離體后，選擇合適的固定液立即固定，固定液的量建議大于組織體積的10-15倍，新鮮標(biāo)本用合適的容器固定24-48h，大標(biāo)本固定12h，再切開(kāi)固定。標(biāo)本常溫（24℃左右）或冷藏（4℃）固定，切勿冷凍結(jié)冰，固定樣本常溫運(yùn)輸送樣。

2、涂片和爬片必須充分固定，石蠟切片實(shí)驗(yàn)前需充分脫蠟。

3、提供準(zhǔn)確的抗體信息。

注意事項(xiàng)：

1、客戶提供的抗體，要求先做預(yù)實(shí)驗(yàn)，除了正式實(shí)驗(yàn)樣本外，需客戶提供預(yù)實(shí)驗(yàn)樣本（預(yù)期高表達(dá)，蠟塊和切片皆可）和陽(yáng)性對(duì)照（若不能提供，可以協(xié)商由我司提供），TSA多標(biāo)實(shí)驗(yàn)需要嚴(yán)格設(shè)置單標(biāo)對(duì)照。

2、抗體：一般指一抗（客戶檢測(cè)目的蛋白），需要客戶提供準(zhǔn)確的抗體名稱、品牌貨號(hào)，根據(jù)抗體貨號(hào)可以確認(rèn)抗體的應(yīng)用（檢測(cè)種屬和檢測(cè)方式）是否符合基本要求，否則存在風(fēng)險(xiǎn)，具體以預(yù)實(shí)驗(yàn)為準(zhǔn)。接收抗體時(shí)，需確認(rèn)抗體體積與保存溫度，建議至少10μl，多余可返還。二抗由我司提供，若客戶提供特殊來(lái)源的一抗（如：綿羊來(lái)源），需客戶提供相應(yīng)二抗。

3、預(yù)實(shí)驗(yàn)，通常采用3+1+1模式，即三個(gè)濃度梯度，一張陽(yáng)性對(duì)照，一張空白對(duì)照。預(yù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)效果后，再做正式實(shí)驗(yàn)，預(yù)實(shí)驗(yàn)我司可提供免費(fèi)掃描并放置于服務(wù)器（可用網(wǎng)頁(yè)直接瀏覽）。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)先由客戶自行確認(rèn)，并選擇正式實(shí)驗(yàn)濃度，我司可協(xié)助推薦，但不對(duì)最終結(jié)果作保證，預(yù)實(shí)驗(yàn)和正式實(shí)驗(yàn)間隔周期不要太久，建議連續(xù)三周內(nèi)完成。

4、同一個(gè)抗體用于不同種屬、不同臟器，濃度都需做預(yù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)（可以減少濃度梯度）。

5、正式實(shí)驗(yàn)的趨勢(shì)我司不做保證。