1.引言

CRISPR-Cas9技術(shù)因其高效、精準(zhǔn)的基因編輯能力，已成為構(gòu)建大鼠基因敲除（KO）模型的首選方法。相較于傳統(tǒng)方法（如ES細(xì)胞打靶），CRISPR技術(shù)周期短、成本低，適用于大規(guī)?；蚬δ苎芯?。皮諾飛生物基于多年CRISPR大鼠模型構(gòu)建經(jīng)驗(yàn)，提供從sgRNA設(shè)計(jì)到表型分析的一站式服務(wù)，成功構(gòu)建超過500種基因敲除大鼠模型，廣泛應(yīng)用于疾病機(jī)制研究、藥物開發(fā)和功能基因組學(xué)。

皮諾飛生物動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)室CRISPR大鼠模型構(gòu)建

本文將系統(tǒng)介紹CRISPR大鼠基因敲除模型的構(gòu)建流程、關(guān)鍵優(yōu)化點(diǎn)、常見問題及解決方案，并結(jié)合皮諾飛生物的特色服務(wù)，為研究者提供標(biāo)準(zhǔn)化操作指南。

2.CRISPR大鼠基因敲除模型構(gòu)建流程

2.1靶點(diǎn)設(shè)計(jì)與sgRNA優(yōu)化

（1）基因結(jié)構(gòu)分析

-確定目標(biāo)基因的外顯子區(qū)域（優(yōu)先選擇首個(gè)功能域或關(guān)鍵外顯子）

-避免脫靶效應(yīng)：使用CRISPRscan、CHOPCHOP等工具預(yù)測(cè)sgRNA效率

-皮諾飛生物提供AI輔助sgRNA設(shè)計(jì)服務(wù)，脫靶率<0.1%

（2）sgRNA合成與驗(yàn)證

|步驟|關(guān)鍵參數(shù)|

|sgRNA合成|化學(xué)修飾（2'-O-methyl增強(qiáng)穩(wěn)定性）|

|體外驗(yàn)證|T7E1酶切或Sanger測(cè)序檢測(cè)切割效率|

|優(yōu)化方案|若效率<60%，需重新設(shè)計(jì)sgRNA|

2.2胚胎顯微注射與基因編輯

（1）受精卵準(zhǔn)備

-選用SD或Wistar大鼠（6-8周齡，SPF級(jí)）

-超排卵處理（PMSG+hCG方案）

（2）CRISPR組分注射

-注射方案：

 -Cas9mRNA+sgRNA（常用，減少脫靶風(fēng)險(xiǎn)）

 -RNP（核糖核蛋白復(fù)合物）（編輯效率更高）

-顯微注射參數(shù)：

 -注射體積：1-2pL/胚胎

 -Cas9濃度：50-100ng/μL

（3）胚胎移植

-注射后胚胎培養(yǎng)至2-細(xì)胞期

-移植至假孕母鼠（移植存活率>80%）

2.3基因型鑒定與建系

（1）初篩（F0代）

-PCR+測(cè)序檢測(cè)突變類型（Indel、大片段缺失等）

-TIDE分析計(jì)算編輯效率

（2）穩(wěn)定品系建立（F1代）

-篩選雜合子（+/-）進(jìn)行互配

-Southernblot或長(zhǎng)片段PCR驗(yàn)證純合子（-/-）

3.關(guān)鍵優(yōu)化點(diǎn)與常見問題

3.1提高編輯效率的策略

|影響因素|優(yōu)化方案|

|---------|---------|

|sgRNA設(shè)計(jì)|選擇高GC含量（40-60%）區(qū)域|

|Cas9遞送方式|RNP比質(zhì)粒更高效|

|胚胎質(zhì)量|使用新鮮受精卵（<2h內(nèi)注射）|

3.2常見問題與解決方案

|問題|可能原因|解決方案|

|------|---------|---------|

|低編輯效率|sgRNA設(shè)計(jì)不佳|重新優(yōu)化sgRNA|

|高嵌合率（F0）|注射時(shí)間延遲|使用早期胚胎（原核期）|

|脫靶效應(yīng)|sgRNA特異性低|選擇高評(píng)分sgRNA或使用HiFiCas9|

4.皮諾飛生物特色服務(wù)

4.1一站式CRISPR大鼠模型構(gòu)建

-從設(shè)計(jì)到表型分析全程服務(wù)

-3個(gè)月快速交付（傳統(tǒng)方法需6-12個(gè)月）

4.2基因編輯質(zhì)控體系

|檢測(cè)項(xiàng)目|方法|

|---------|------|

|脫靶分析|全基因組測(cè)序（WGS）|

|表型驗(yàn)證|WB/qPCR/免疫組化|

4.3典型應(yīng)用案例

-案例1：構(gòu)建ApoE敲除大鼠（動(dòng)脈粥樣硬化研究）

-案例2：IL-10KO大鼠（炎癥性腸病模型）

5.結(jié)論

CRISPR技術(shù)極大促進(jìn)了大鼠基因敲除模型的構(gòu)建效率，但仍需優(yōu)化sgRNA設(shè)計(jì)、胚胎操作和基因型鑒定等關(guān)鍵步驟。皮諾飛生物提供高成功率、低脫靶率的CRISPR大鼠模型構(gòu)建服務(wù)，助力基因功能研究與藥物開發(fā)。

如需獲取詳細(xì)技術(shù)方案或案例數(shù)據(jù)，請(qǐng)聯(lián)系皮諾飛生物技術(shù)團(tuán)隊(duì)！www.intechopen.com.cn 15392937510。