1.引言

CRISPR-Cas9技術因其高效、精準的基因編輯能力，已成為構建大鼠基因敲除（KO）模型的首選方法。相較于傳統(tǒng)方法（如ES細胞打靶），CRISPR技術周期短、成本低，適用于大規(guī)?；蚬δ苎芯俊ＦぶZ飛生物基于多年CRISPR大鼠模型構建經驗，提供從sgRNA設計到表型分析的一站式服務，成功構建超過500種基因敲除大鼠模型，廣泛應用于疾病機制研究、藥物開發(fā)和功能基因組學。

皮諾飛生物動物模型實驗室CRISPR大鼠模型構建

本文將系統(tǒng)介紹CRISPR大鼠基因敲除模型的構建流程、關鍵優(yōu)化點、常見問題及解決方案，并結合皮諾飛生物的特色服務，為研究者提供標準化操作指南。

2.CRISPR大鼠基因敲除模型構建流程

2.1靶點設計與sgRNA優(yōu)化

（1）基因結構分析

-確定目標基因的外顯子區(qū)域（優(yōu)先選擇首個功能域或關鍵外顯子）

-避免脫靶效應：使用CRISPRscan、CHOPCHOP等工具預測sgRNA效率

-皮諾飛生物提供AI輔助sgRNA設計服務，脫靶率<0.1%

（2）sgRNA合成與驗證

|步驟|關鍵參數(shù)|

|sgRNA合成|化學修飾（2'-O-methyl增強穩(wěn)定性）|

|體外驗證|T7E1酶切或Sanger測序檢測切割效率|

|優(yōu)化方案|若效率<60%，需重新設計sgRNA|

2.2胚胎顯微注射與基因編輯

（1）受精卵準備

-選用SD或Wistar大鼠（6-8周齡，SPF級）

-超排卵處理（PMSG+hCG方案）

（2）CRISPR組分注射

-注射方案：

 -Cas9mRNA+sgRNA（常用，減少脫靶風險）

 -RNP（核糖核蛋白復合物）（編輯效率更高）

-顯微注射參數(shù)：

 -注射體積：1-2pL/胚胎

 -Cas9濃度：50-100ng/μL

（3）胚胎移植

-注射后胚胎培養(yǎng)至2-細胞期

-移植至假孕母鼠（移植存活率>80%）

2.3基因型鑒定與建系

（1）初篩（F0代）

-PCR+測序檢測突變類型（Indel、大片段缺失等）

-TIDE分析計算編輯效率

（2）穩(wěn)定品系建立（F1代）

-篩選雜合子（+/-）進行互配

-Southernblot或長片段PCR驗證純合子（-/-）

3.關鍵優(yōu)化點與常見問題

3.1提高編輯效率的策略

|影響因素|優(yōu)化方案|

|---------|---------|

|sgRNA設計|選擇高GC含量（40-60%）區(qū)域|

|Cas9遞送方式|RNP比質粒更高效|

|胚胎質量|使用新鮮受精卵（<2h內注射）|

3.2常見問題與解決方案

|問題|可能原因|解決方案|

|------|---------|---------|

|低編輯效率|sgRNA設計不佳|重新優(yōu)化sgRNA|

|高嵌合率（F0）|注射時間延遲|使用早期胚胎（原核期）|

|脫靶效應|sgRNA特異性低|選擇高評分sgRNA或使用HiFiCas9|

4.皮諾飛生物特色服務

4.1一站式CRISPR大鼠模型構建

-從設計到表型分析全程服務

-3個月快速交付（傳統(tǒng)方法需6-12個月）

4.2基因編輯質控體系

|檢測項目|方法|

|---------|------|

|脫靶分析|全基因組測序（WGS）|

|表型驗證|WB/qPCR/免疫組化|

4.3典型應用案例

-案例1：構建ApoE敲除大鼠（動脈粥樣硬化研究）

-案例2：IL-10KO大鼠（炎癥性腸病模型）

5.結論

CRISPR技術極大促進了大鼠基因敲除模型的構建效率，但仍需優(yōu)化sgRNA設計、胚胎操作和基因型鑒定等關鍵步驟。皮諾飛生物提供高成功率、低脫靶率的CRISPR大鼠模型構建服務，助力基因功能研究與藥物開發(fā)。

如需獲取詳細技術方案或案例數(shù)據(jù)，請聯(lián)系皮諾飛生物技術團隊！www.intechopen.com.cn 15392937510。