透射電鏡

透射電鏡（transmission electron microscopy，TEM） 因用電子束穿透樣品、產(chǎn)生物像而得名。由于電子易被散射或被樣品吸收，故穿透力低，須制備超薄切片（50～80mm）。取材要盡量新鮮，以保存細(xì)胞正常的超微結(jié)構(gòu)。組織塊（1mm3以內(nèi)）用戊二醛與鎳酸兩次固定，脫水后樹脂包埋，用超薄切片機(jī)切片，再經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛染色。電子束射落到切片時，隨細(xì)胞構(gòu)成成分的密度以及吸附重金屬鈾、鉛、俄的程度不同，而發(fā)生相應(yīng)的電子散射。當(dāng)電子束投射到密度大、吸附重金屬多的結(jié)構(gòu)（如溶酶體）時，電子被散射的多，因此，射落到熒光屏上的電子少而呈暗像，電鏡照片上呈黑或深灰色，習(xí)慣稱該結(jié)構(gòu)為高電子密度（electron-density）；反之呈淺灰色，稱低電子密度。透射電鏡可以看到在光學(xué)顯微鏡下無法看清的小于0.2um的細(xì)微結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)稱為亞顯微結(jié)構(gòu)或超微結(jié)構(gòu)，小分辨率0.2nm。

透射電鏡應(yīng)用

形貌觀察：

可觀察納米尺度的微觀形貌

如：動植物的細(xì)胞器 納米材料 病毒細(xì)菌等

分析：

電子衍射花樣：晶格點(diǎn)陣 晶體結(jié)構(gòu)

能譜EDS分析：元素分析 定性半定量

掃描透射STEM：明場像 暗場像

其他：如原位 冷凍 三維重構(gòu)

透射電鏡制樣流程

取材-固定-脫水-滲透-包埋-修塊-定位-切片-染色-拍照

透射電鏡固定劑

前固定：戊二醛（Glutaric dialdehyde C5H8O2）

戊二醛的優(yōu)點(diǎn)是對糖原，糖蛋白，微管，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞基質(zhì)等有較好的固定作用，對組織和細(xì)胞的穿透力比四氧化鋨強(qiáng)，還能保持某些酶的活力，長時間的固定（幾周甚至1-2個月）不會使組織變脆。

缺點(diǎn)：對脂類無固定作用，無電子染色作用，對細(xì)胞膜的顯示較差。

后固定：四氧化鋨（osmium tetroxide）

是一種氧化劑，與氮原子有較強(qiáng)的親和力，因而對于細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)成分有良好的固定作用。它還能與不飽和脂肪酸反應(yīng)使脂肪得以固定。此外，四氧化鋨還能固定脂蛋白，使生物膜結(jié)構(gòu)的主要成分磷脂蛋白穩(wěn)定。它還能與變性DNA以及核蛋白反應(yīng)，但不能固定天然DNA，RNA及糖原。四氧化鋨固定劑有強(qiáng)烈的電子染色作用，用它固定的樣品圖像反差較好。鋨固定的時間一般為1-2小時。

缺點(diǎn)：滲入組織慢，不能固定糖原、核酸及糖類，有劇毒。

透射電鏡樣本處理

首先需要做電鏡的樣本必須盡量新鮮，固定液或懸浮液都不得冷凍結(jié)冰

1 動物組織樣本

在1-3分鐘內(nèi)取樣，取樣組織1立方毫米，盡量薄，可在4度預(yù)冷電鏡固定液內(nèi)修整大小，超時后會有細(xì)胞器損傷；取材時盡量精確到需要觀察的目標(biāo)部位進(jìn)行固定，壞死比較嚴(yán)重的灶點(diǎn)可取病灶周邊代替；取材時一定注意避免鑷子擠壓等機(jī)械損傷，刀片要鋒利避免挫傷組織，可使用刮胡刀雙面刀片。組織取下后立即投入電鏡固定液內(nèi)，室溫避光固定2小時，再轉(zhuǎn)移至4℃保存，4℃冰袋運(yùn)輸，在保存和運(yùn)輸過程中固定液切勿冷凍結(jié)冰。

2 植物組織樣本

取材要求同動物組織樣本，盡可能的新鮮；另外組織投入固定液后需要進(jìn)行真空抽氣讓組織沉底，如無條件抽氣可用濾紙或脫脂棉將組織壓入進(jìn)固定液內(nèi)，組織不能漂浮在固定液表面。

3 細(xì)胞樣本

貼壁細(xì)胞：

方法一：

培養(yǎng)好的細(xì)胞棄培養(yǎng)基，加入2.5％的常溫戊二醛固定液；常溫固定5分鐘左右，用細(xì)胞刮（或軟橡膠蓋切得平整小方塊）沿一個方向輕輕刮下細(xì)胞，切記不要反復(fù)刮，避免細(xì)胞刮破。用巴氏吸管把細(xì)胞液注入離心管內(nèi)，加入離心機(jī)（不超過3000轉(zhuǎn)），離心2分鐘左右，細(xì)胞團(tuán)要有綠豆大小；棄固定液后加新的電鏡固定液，把細(xì)胞團(tuán)輕輕挑起或者吹散，懸浮于固定液中；室溫避光固定30分鐘，再轉(zhuǎn)移至4℃保存，4℃冰袋運(yùn)輸。

方法二：（對細(xì)胞形態(tài)沒有要求的）

培養(yǎng)好的細(xì)胞棄培養(yǎng)基，加入胰酶；胰酶消化好后（時間不宜過長），用培養(yǎng)基終止消化，用吸管把細(xì)胞吹下來?；厥针x心管，離心（不超過3000轉(zhuǎn)），2分鐘左右，細(xì)胞團(tuán)要有綠豆大?。粭壣锨?，加入2.5％的常溫戊二醛固定液，把細(xì)胞團(tuán)輕輕挑起，懸浮于固定液中；室溫避光固定30分鐘，再轉(zhuǎn)移至4℃保存，4℃冰袋運(yùn)輸。

懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞要肉眼可見細(xì)胞沉淀綠豆大小，棄培養(yǎng)基后加電鏡固定液室溫避光固定30分鐘，再轉(zhuǎn)移至4℃保存，4℃冰袋運(yùn)輸。

4 細(xì)菌樣本

固體培養(yǎng)基的細(xì)菌：連帶著培養(yǎng)基一起挑下細(xì)菌放于電鏡固定液內(nèi)部室溫避光固定2小時，再轉(zhuǎn)移至℃保存，4℃冰袋運(yùn)輸。

懸浮細(xì)菌孢子等：離心收集細(xì)菌要肉眼可見細(xì)菌沉淀綠豆大小，棄培養(yǎng)基后加電鏡固定液室內(nèi)避光固定2h，再轉(zhuǎn)移至4℃保存，4℃冰袋運(yùn)輸。

5 病毒

破碎組織細(xì)胞，粗離心去除細(xì)胞碎片取上清，超速離心分離出病毒（病毒提取的過程需要客戶自己完成）。用緩沖液（如PBS）懸浮病毒，至少50ul，遠(yuǎn)距離-80℃凍存運(yùn)輸，近距離4℃保存運(yùn)輸，盡快滴片做負(fù)染后及時電鏡觀察拍照。

6 外泌體囊泡等

客戶自己完成外泌體囊泡等的提取收集，至少50ul，用緩沖液（如PBS）或試劑盒中的保存液懸浮液，遠(yuǎn)距離-80℃凍存運(yùn)輸，近距離4℃保存運(yùn)輸，盡快制片做負(fù)染（因此類樣品極易降解，樣品越新鮮越好，數(shù)小時內(nèi)完成滴片負(fù)染，否則造成的效果很不理想甚至完全觀察不到）。

7 納米材料等無機(jī)材料

直接準(zhǔn)備粉劑或用緩沖液（如PBS）、純水、無水乙醇懸浮，常溫保存運(yùn)輸即可（需要超聲的備注），做負(fù)染后電鏡觀察拍照。

實驗圖例