實(shí)驗(yàn)原理

熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)是以熒光素(luciferin) 為底物來(lái)檢測(cè)熒光素酶活性的一種報(bào)告系統(tǒng)。熒光素酶可 以催化 luciferin 氧化成 oxyluciferin, 在 luciferin 氧化的過(guò)程中，會(huì)發(fā)出生物熒光(bioluminescence)。然后  可以通過(guò)熒光測(cè)定儀(化學(xué)發(fā)光儀)測(cè)定 luciferin 氧化過(guò)程中釋放的生物熒光。熒光素和熒光素酶這一生物 發(fā)光體系，可以極其靈敏、高效地檢測(cè)基因的表達(dá)。

雙熒光素酶體系，即有兩種熒光素酶，比較常見的組合是螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶，螢火蟲熒光 素酶作用于甲蟲熒光素，而海腎熒光素酶在氧的存在下作用于海腎熒光素。以其中一個(gè)作為內(nèi)參對(duì)照，即表 達(dá)量基本恒定，用于減少試驗(yàn)中不同處理間所固有的變化，包括培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目及活力的差異，細(xì)胞轉(zhuǎn)染及 裂解的效率，而另外一個(gè)熒光素酶則作為報(bào)告基因，用于指示不同處理?xiàng)l件下基因的表達(dá)情況。

實(shí)驗(yàn)應(yīng)用

潛在啟動(dòng)子/啟動(dòng)子核心區(qū)域檢測(cè)；

潛在增強(qiáng)子/抑制子等調(diào)控子核心元件檢測(cè)；

啟動(dòng)子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)檢測(cè)；

啟動(dòng)子/增強(qiáng)子與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用；

病毒/細(xì)胞相互作用；

藥物等化學(xué)誘導(dǎo)因素對(duì)啟動(dòng)子活性的調(diào)節(jié)(抑制或增強(qiáng));

射線等物理誘導(dǎo)因素對(duì)啟動(dòng)子活性的調(diào)節(jié)(抑制或增強(qiáng));

microRNA 靶基因驗(yàn)證。

以雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行 microRNA 靶基因驗(yàn)證為例，介紹相關(guān)的實(shí)驗(yàn)流程。

結(jié)果展示

pGL3-Basic Vector為骨架插入目的基因5'-UTR 序列

熒光素酶質(zhì)粒構(gòu)建