外泌體（Exosomes）是直徑在30-150納米之間的細(xì)胞外囊泡，在細(xì)胞間通訊、信號(hào)傳遞、廢物排出等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)，外泌體因其在癌癥診斷、藥物遞送等領(lǐng)域的潛在應(yīng)用，受到了廣泛關(guān)注。為了深入理解外泌體的結(jié)構(gòu)與功能，透射電子顯微鏡（TEM）成為不可或缺的工具。要在電鏡下成功觀察到高分辨率的外泌體圖像，樣品的制備尤為關(guān)鍵。本文將為大家詳細(xì)講解如何制備高質(zhì)量的外泌體電鏡樣品。

外泌體電鏡

1.樣品的獲取與純化

制備高質(zhì)量的外泌體電鏡樣品的首要步驟是從生物樣本中分離并純化外泌體。常見的外泌體提取方法有超速離心法、密度梯度離心法和免疫親和捕獲法等。在這些方法中，超速離心法是應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一。通過(guò)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基、血漿、尿液等生物液體進(jìn)行超速離心，可以得到相對(duì)純凈的外泌體樣品。

值得注意的是，提取后的外泌體樣品中往往還含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等雜質(zhì)，可能會(huì)影響電鏡觀察。因此，進(jìn)一步的純化步驟，如密度梯度離心和透析法，將有助于提高樣品的純凈度，為后續(xù)的電鏡觀察奠定基礎(chǔ)。

2.樣品固定與預(yù)處理

外泌體是一類微小的納米顆粒，它們的結(jié)構(gòu)極其脆弱，易受到環(huán)境變化的影響。在制備電鏡樣品時(shí)，必須通過(guò)適當(dāng)?shù)墓潭ㄊ侄?，保持外泌體的完整性和原有結(jié)構(gòu)。常用的固定劑是戊二醛和鋨酸，這兩者都能夠有效地交聯(lián)外泌體的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)膜，防止其在制備過(guò)程中的塌陷或變形。

固定后，樣品需要經(jīng)過(guò)一系列脫水和包埋處理。脫水通常采用梯度乙醇系列（例如30%、50%、70%、90%、100%）對(duì)樣品進(jìn)行逐級(jí)處理，去除樣品中的水分，使其更加穩(wěn)定。在包埋過(guò)程中，環(huán)氧樹脂是一種常用的包埋材料，它可以在后續(xù)的切片過(guò)程中，提供更好的支持。

通過(guò)固定和預(yù)處理，外泌體樣品的形態(tài)結(jié)構(gòu)將得到良好保留，為電鏡下的詳細(xì)觀察創(chuàng)造條件。

3.樣品負(fù)染與超薄切片

為了增強(qiáng)外泌體在電鏡下的對(duì)比度，負(fù)染色是一個(gè)必不可少的步驟。常見的負(fù)染色劑有磷鎢酸和醋酸鈾，這些化學(xué)物質(zhì)可以填充外泌體周圍的空隙，形成一個(gè)陰影效果，從而增強(qiáng)外泌體與背景之間的對(duì)比度。負(fù)染色后的樣品在電鏡下能夠清晰呈現(xiàn)外泌體的形態(tài)，尤其是外泌體的雙層膜結(jié)構(gòu)。

對(duì)于更細(xì)致的結(jié)構(gòu)分析，如觀察外泌體內(nèi)部的成分，則需要采用超薄切片技術(shù)。這一步驟涉及將包埋好的樣品切成超薄的薄片，通常厚度為50-100納米，以便于電子束能夠穿透樣品。超薄切片后，可以通過(guò)電鏡詳細(xì)分析外泌體內(nèi)部的蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的分布與排列。

4.電鏡成像與數(shù)據(jù)分析

在樣品制備完成后，將其置于透射電鏡下進(jìn)行觀察。透射電鏡可以產(chǎn)生納米級(jí)分辨率的圖像，揭示外泌體的三維結(jié)構(gòu)和內(nèi)部組成。成像過(guò)程中，科學(xué)家可以選擇不同的電壓、放大倍數(shù)等參數(shù)，以獲得最清晰、最詳細(xì)的外泌體圖像。

觀察完成后，電鏡圖像需要經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)分析與處理，通常包括對(duì)外泌體的直徑分布、形態(tài)特征以及內(nèi)部成分的定量分析。這些數(shù)據(jù)能夠?yàn)楹罄m(xù)的生物學(xué)研究提供關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。例如，通過(guò)分析外泌體的大小和形態(tài)差異，研究人員可以推測(cè)它們?cè)诓煌±頎顟B(tài)下的作用機(jī)制。

外泌體的電鏡樣品制備是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的過(guò)程，涵蓋了樣品的提取、固定、負(fù)染、超薄切片到成像和數(shù)據(jù)分析的多個(gè)步驟。每一步都對(duì)最終的圖像質(zhì)量有重要影響。通過(guò)掌握這一技術(shù)，科研人員可以更好地理解外泌體的結(jié)構(gòu)與功能，為腫瘤研究、藥物開發(fā)等領(lǐng)域的突破性成果提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

了解并掌握外泌體電鏡樣品制備方法，不僅能提高實(shí)驗(yàn)的成功率，更能為科研人員提供新的研究方向與思路，推動(dòng)納米醫(yī)學(xué)及相關(guān)領(lǐng)域的前沿探索。