染色步驟

一.直接法

（1）將冷凍切片、涂片、印片或單層細胞培養(yǎng)物按要求進行固定，石蠟切片一般會在除蠟后經(jīng)過酶消化處理，然后水化。隨后，用0.01mol/L PH7.2---7.4的PBS洗滌5分鐘，在冷風(fēng)中風(fēng)干后，將樣品放入帶有水的盒子中。

（2）添加稀釋后的熒光抗體，37℃孵育30-60分鐘或4℃過夜 (3) 用PBS 緩沖液洗滌2次，蒸餾水洗滌1次

（3）含有50%甘油的緩沖液片劑

使用熒光顯微鏡進行檢查

（4）比對染色

①陽性控制是指將已經(jīng)確認含有目標抗原的組織切片與待檢標本同等處理，預(yù)期結(jié)果為陽性。

②陰性對照是指使用已知不含目標抗原的組織切片與待檢樣本進行相同處理，預(yù)期結(jié)果為陰性。

③進行空白對照實驗，使用缺乏特異性抗體或PBS替代特異性抗體，結(jié)果應(yīng)呈陰性反應(yīng)。

④進行抑制實驗時，將熒光抗體標記和非標記抗體或血清等量混合后，按照上述方法處理樣本切片，預(yù)期的結(jié)果應(yīng)為陰性（一步法）。

將待檢驗的切片分成兩組，一組加入未標記的特異性血清，另一組加入未標記的同種正常血清，進行孵育后沖洗，隨后加入標記的特異性血清（例如熒光標記的抗體）。因為加入了未標記的特異性血清后，切片上的抗原已被結(jié)合，導(dǎo)致染色效果不顯著，呈現(xiàn)陰性結(jié)果；而加入同種正常血清的切片則會顯示陽性反應(yīng)（二步法）。

進行染色時要做好對照工作，在開始實驗時要進行全面的對照，每次實驗都需要進行陰性和陽性對照。

二.間接法

(1) 樣本處理方式與直接方法相同。

將適量稀釋后的特異性抗體滴加到樣本上，放入濕盒中，在37攝氏度下孵育30至60分鐘，或者在4攝氏度下過夜。

在濕盒中放入已適當稀釋的間接熒光抗體，并將溫度控制在37℃，處理時間為30至60分鐘。

使用PBS溶液進行兩次洗滌，然后用雙蒸蒸餾水洗滌一次。

使用甘油緩沖液封裝玻片，并在熒光顯微鏡下進行觀察。

染色對照：可使用陰性對照和空白對照進行比較。

三.補體法

⑴標本處理與直接法相同。

⑵將適量稀釋的特異性抗體和相同量的補體混合后滴加入濕盒中，在37攝氏度下孵育30分鐘，然后用磷酸緩沖鹽水洗滌3次。

⑶將經(jīng)過適當稀釋的抗補體熒光抗體滴加到培養(yǎng)皿中，放置在37攝氏度下30分鐘。用磷酸緩沖鹽水洗滌2次，再用蒸餾水洗滌1次。

⑷用甘油緩沖液封裝片劑。

⑸在對照染色時，可以用正常血清替代，即經(jīng)過56攝氏度30分鐘的滅活處理后，將滅活的補體與特異性抗體等量混合，然后進行染色，結(jié)果應(yīng)當呈陰性。

四.雙重染色熒光技術(shù)

當需要直接檢測同一樣本中的兩種抗原時，可以使用不同的熒光染料來分別標記抗體。

雙重染色一步法：先混合兩種不同標記的抗體，按照直接染色的步驟進行。

雙染色的二步法：首先孵育一個標記抗體，無需沖洗，然后再孵育另一個標記抗體，按照間接法的步驟進行。

五.注意事項

免疫熒光法適合于冰凍切片染色，因為這種切片通常保存抗原的能力更好。若選擇石蠟切片，則應(yīng)優(yōu)先考慮免疫酶法等染色技術(shù)。

使用熒光標記的商品抗體進行染色前，應(yīng)該先確定抗體的效力，找到適合的稀釋倍數(shù)后再進行成批染色。一般來說，當陽性物質(zhì)呈明亮熒光而背景較暗時的稀釋倍數(shù)是最適合的。高稀釋倍數(shù)的熒光抗體可減少非特異性染色，使染色結(jié)果更具特異性，但若稀釋倍數(shù)過高則可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

熒光抗體稀釋度較低時，有利于觀察結(jié)果，但可能會導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性的染色，甚至產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

除去非特異性熒光。要去除非特異性熒光有很多種方法。通常情況下，冰凍切片的非特異性熒光會更明顯，而石蠟切片的非特異性熒光相對較輕。常見的處理方法包括：

①先使用非免疫血清（如10%牛血清）處理組織切片，然后進行熒光染色。

2. 通過小鼠相應(yīng)組織的干粉吸收熒光抗體中的非特異性成份。

③確定適當?shù)南♂尡壤颓衅穸取?/span>

選擇具有高特異性和高效力的熒光抗體。

（清洗必須要徹底。每一步驟都需要使用蒸餾水或緩沖液進行清洗，以清除殘留在切片中的試劑，以達到特異著色的目的。在清洗時，無論是沖洗還是振蕩清洗，都應(yīng)遵循基本原則，確保清洗徹底，或者說充分稀釋上一步驟中的試劑，使其濃度降至最低。

只要有充足的時間，建議使用靜置廷長的洗滌時間，以防止脫片，這是一個較好的方法。洗滌液的PH值應(yīng)該在7.2~7.4之間，太高或太低都不利于染色過程，特別是在偏堿性的PH值條件下。

孵化時間和溫度。通常最佳的時間和溫度是37℃，持續(xù)20至30分鐘。當然，這也與抗體的強度、組織抗原的含量和位置、切片的厚度等因素有關(guān)。