探尋生命奧秘，蛋白免疫印跡（Western Blot）如一把生物學(xué)解碼器，為我們揭示蛋白質(zhì)的神秘面紗。它的原理簡(jiǎn)單而玄妙，通過(guò)電泳分離、傳遞和檢測(cè)蛋白質(zhì)，將微觀(guān)的生命活動(dòng)呈現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室的熒屏上。今天皮諾飛生物帶大家學(xué)習(xí)蛋白免疫印跡western blot的基本原理和實(shí)踐操作！

免疫印跡western blot實(shí)驗(yàn)操作

簡(jiǎn)介

免疫印跡，又被稱(chēng)為蛋白質(zhì)印跡（Western blot，WB），是一種復(fù)合性的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。該方法通過(guò)利用SDS-PAGE技術(shù)，在生物樣本中將蛋白質(zhì)分子根據(jù)其分子量在凝膠上進(jìn)行分離，隨后通過(guò)電轉(zhuǎn)移的方式將這些蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上。固相膜上的蛋白質(zhì)充當(dāng)抗原，與相應(yīng)的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，接著與酶標(biāo)記的第二抗體發(fā)生反應(yīng)。最終，通過(guò)底物顯色或熒光成像等手段，檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)。

該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于研究基因在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)、檢測(cè)抗體活性以及早期診斷疾病等多個(gè)領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)原理

蛋白質(zhì)免疫印跡法，即Western Blot，基本原理涉及通過(guò)PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離，隨后將其轉(zhuǎn)移至固相載體，如硝酸纖維素薄膜（NC膜）或PVDF膜。固相載體以非共價(jià)鍵方式吸附蛋白質(zhì)，同時(shí)能夠保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性的不變性。

在該過(guò)程中，固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽被作為抗原，與相應(yīng)的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，隨后與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體發(fā)生反應(yīng)。最終，通過(guò)底物顯色或放射自顯影等手段，實(shí)現(xiàn)對(duì)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分的檢測(cè)。

這一方法的關(guān)鍵在于其能夠通過(guò)將蛋白質(zhì)固定在固相載體上并與特異性抗體相互作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白的高靈敏度和高特異性檢測(cè)。這種分析手段在研究蛋白質(zhì)表達(dá)和功能、抗體診斷以及生物醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮著重要的作用。

應(yīng)用

(1) 從蛋白質(zhì)混合物中檢出目標(biāo)蛋白質(zhì)；

(2) 定量或定性確定細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)情況；

(3) 用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA相互作用后續(xù)分析；

實(shí)驗(yàn)流程

WB常規(guī)實(shí)驗(yàn)流程

步驟：

一、試劑準(zhǔn)備

二、蛋白樣品制備

三、蛋白含量的測(cè)定

四、SDS - PAGE電泳

五、轉(zhuǎn)膜

六、免疫反應(yīng)

七、化學(xué)發(fā)光，顯影，定影

八、凝膠圖象分析

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)材料：蛋白質(zhì)樣品。

試劑、試劑盒：裂解液 PBS G 250考馬斯亮藍(lán)溶液 NaCl SDS上樣緩沖液 電泳緩沖液 轉(zhuǎn)移緩沖液 麗春紅染液 封閉液 TBST TBS 洗脫抗體緩沖液 顯影液 定影液 抗體 化學(xué)發(fā)光試劑。

儀器、耗材：高壓鍋 玻璃勻漿器 高速離心機(jī) 分光光度儀 -20℃低溫冰箱 垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置 恒溫水浴搖床 多用脫色搖床。

實(shí)驗(yàn)步驟

一、蛋白樣品的制備

1.單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。?/span>

①去除培養(yǎng)液，并將培養(yǎng)瓶倒扣在吸水紙上，確保吸水紙充分吸取殘余培養(yǎng)液（或者將瓶直立放置片刻，使殘余培養(yǎng)液流至瓶底，然后用移液器吸?。?/span>

②向每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入3 ml 4℃預(yù)冷的PBS（0.01 M pH 7.2～7.3）。輕輕搖晃培養(yǎng)瓶進(jìn)行1分鐘的細(xì)胞洗滌，然后棄去洗液。重復(fù)上述步驟兩次，總共進(jìn)行三次洗滌以去除培養(yǎng)液。將PBS棄凈后，將培養(yǎng)瓶放置于冰上。

③在冰上，向每瓶中加入1 ml裂解液，并加入10 μl PMSF（100 mM）。搖勻混合。（PMSF應(yīng)在無(wú)結(jié)晶的情況下?lián)u勻再與裂解液混合。）

④向每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入400 μl含PMSF的裂解液，放置于冰上裂解30分鐘。為確保細(xì)胞充分裂解，要經(jīng)常來(lái)回?fù)u動(dòng)培養(yǎng)瓶。

⑤裂解完成后，迅速用干凈的刮棒將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶的一側(cè)刮下（動(dòng)作迅速），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液轉(zhuǎn)移到1.5 ml 離心管中。整個(gè)操作最好在冰上進(jìn)行。

⑥在4℃下進(jìn)行12000 rpm離心5分鐘（提前開(kāi)啟離心機(jī)進(jìn)行預(yù)冷）。

⑦將離心后的上清分裝至0.5 ml 離心管中，迅速轉(zhuǎn)移到-20℃保存。

2.組織中總蛋白的提?。?/span>

①取少量組織塊并置于1～2 ml 勻漿器的球狀部位，使用清潔的剪刀將組織塊徹底剪碎。

②向勻漿器中加入400 ml含有PMSF的單一去污劑裂解液，進(jìn)行勻漿。隨后將勻漿器置于冰上。

③過(guò)幾分鐘后，再次進(jìn)行碾磨，然后再次放置于冰上。這個(gè)過(guò)程需要重復(fù)幾次，以確保組織塊充分碾碎。

④裂解30分鐘后，使用移液器將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 ml 離心管中。隨后，在4℃下進(jìn)行12000 rpm離心5分鐘，將上清液分裝至0.5 ml 離心管中，并存放于-20℃。

3.加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。?/span>

①將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至1.5 ml 離心管中，進(jìn)行2500 rpm 離心5分鐘。

②丟棄上清液，加入4 ml 冷卻至4℃的PBS，并輕輕使用槍進(jìn)行吹洗，然后再次進(jìn)行2500 rpm 離心5分鐘。丟棄上清液后，用PBS重復(fù)洗滌一次。

③使用槍將細(xì)胞洗凈后，向每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入含有PMSF的100 μl裂解液，并進(jìn)行在冰上的裂解，持續(xù)30分鐘。在裂解過(guò)程中，要定期輕輕彈動(dòng)以確保細(xì)胞充分裂解。

④將裂解液與培養(yǎng)瓶中的裂解液混合后，在4℃下進(jìn)行12000 rpm離心5分鐘。

⑤將離心后的上清液分裝至0.5 ml 離心管中，并迅速放置于-20℃保存。

二、蛋白含量的測(cè)定

（1） 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

①制備BSA溶液：

從-20℃取出1 mg/ml BSA，并在室溫下融化，備用。

②準(zhǔn)備離心管組：

取18個(gè)1.5 ml 離心管，按3個(gè)一組進(jìn)行分組，并為每組分別標(biāo)記為0 μg，2.5 μg，5.0 μg，10.0 μg，20.0 μg，40.0 μg。

③添加試劑：

根據(jù)以下表格，在各個(gè)離心管中加入相應(yīng)的試劑。

④混勻步驟：

將混合后的樣品在室溫下放置2分鐘，以確保樣品充分混合。

⑤比色分析：

使用生物分光光度計(jì)（Bio－Photometer，Eppentoff）進(jìn)行比色分析。

將混勻后的樣品分別加載到生物分光光度計(jì)的測(cè)量室。

通過(guò)設(shè)定合適的波長(zhǎng)，測(cè)量吸光度，并記錄相應(yīng)的數(shù)據(jù)。

（2） 檢測(cè)樣品蛋白含量

①準(zhǔn)備考馬斯亮藍(lán)溶液：

取足量的1.5 ml 離心管，每管加入1 ml 4℃儲(chǔ)存的考馬斯亮藍(lán)溶液。在室溫下放置30分鐘，使其充分與蛋白發(fā)生反應(yīng)。

②制備空白樣品：

取一管考馬斯亮藍(lán)，加入0.15 mol/L NaCl溶液100 μl?；靹蚝蠓胖?/span>2分鐘，作為空白樣品。將空白倒入比色杯中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)程序下進(jìn)行測(cè)量。

③清洗比色杯：

棄空白樣品，用無(wú)水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5 ml），然后用無(wú)菌水洗一次。

④測(cè)量樣品：

取一管考馬斯亮藍(lán)，加入95 μl 0.15 mol/L NaCl NaCl溶液和5 μl待測(cè)蛋白樣品?；靹蚝箪o置2分鐘，倒入扣干的比色杯中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)程序下進(jìn)行測(cè)量。

注意事項(xiàng)：

在每次測(cè)量樣品之前，都要用無(wú)水乙醇清洗比色杯2次，然后用無(wú)菌水洗一次。

可以同時(shí)混合多個(gè)樣品再一起測(cè)，以提高效率。測(cè)得的結(jié)果即為5 μl樣品所含的蛋白量。

三、SDS - PAGE電泳

(1) 清洗玻璃板：

①一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉輕輕擦洗。

②兩面都擦洗過(guò)后用自來(lái)水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。

(2) 灌膠與上樣：

① 將玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊，然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。操作時(shí)要使兩玻璃對(duì)齊，以免漏膠。

② 配制10%分離膠，加入TEMED后搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)，可用10 ml 槍吸取5 ml 膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線(xiàn)高度時(shí)即可。加一層水，液封后的膠凝固更快。

③當(dāng)水和膠之間有一條折射線(xiàn)時(shí)，說(shuō)明膠已凝。等3 min 使膠充分凝固，然后倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。

④配制4%的濃縮膠，加入TEMED后灌膠。將剩余空間灌滿(mǎn)濃縮膠，然后插入梳子。灌膠時(shí)膠要沿玻璃板流下，插梳子時(shí)梳子要水平。膠凝固時(shí)要在兩邊補(bǔ)膠，待濃縮膠凝固后，將梳子輕輕拔出。

⑤用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外，若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板，有字的一面面向外。

(3) 上樣：

①測(cè)完蛋白含量后，計(jì)算含50 μg蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至0.5 ml 離心管中，加入5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×。

②上樣前要將樣品于沸水中煮5 min使蛋白變性。

③加足夠的電泳液后，用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。

(4) 電泳：

電泳時(shí)間一般為4～5小時(shí)，電壓為40 V或60 V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，準(zhǔn)備進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

四、轉(zhuǎn)膜

(1) 膜的準(zhǔn)備：

①戴手套，準(zhǔn)備6張直徑為7.0～8.3 cm的濾紙和1張直徑為7.3～8.6 cm的硝酸纖維素膜。

②將硝酸纖維素膜浸泡于水中2小時(shí)，使用鑷子捏住膜一側(cè)輕輕放入水中，確保膜浮在水表面，避免形成氣泡層。

③將浸過(guò)水的膜取出晾干備用。手上的蛋白容易污染膜，因此切濾紙和膜時(shí)務(wù)必佩戴手套。

(2) 轉(zhuǎn)膜裝置的準(zhǔn)備：

①在搪瓷盤(pán)中放入轉(zhuǎn)膜用夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過(guò)的膜。

②將夾子打開(kāi)，使黑色一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒反復(fù)搟幾次以排除氣泡，一手搟另一手要壓住墊子以保持固定。在墊子上疊放三層濾紙，用玻棒搟去其中的氣泡。

(3) 膠的處理：

①將玻璃板撬掉，小心撬除小玻璃板，刮去濃縮膠，注意避免刮破分離膠。

②將分離膠蓋在濾紙上，用手調(diào)整使其對(duì)齊，用玻棒搟去氣泡。將膜蓋在膠上，確保蓋滿(mǎn)整個(gè)膠，并排除氣泡。

③在膜上蓋3張濾紙并去除氣泡。然后蓋上另一塊海綿墊，搟幾下后合上夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，不斷搟去氣泡。確保膜兩邊的濾紙不相互接觸，以避免短路。轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時(shí)要戴手套，保持實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)。

(4) 電轉(zhuǎn)移：

①將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中，確保夾子的黑色一面對(duì)著槽的黑面，夾子的白色一面對(duì)著槽的紅面。槽的一側(cè)放置冰塊來(lái)降溫，因?yàn)殡娹D(zhuǎn)移會(huì)產(chǎn)生熱。

②電轉(zhuǎn)移一般使用60 V轉(zhuǎn)移2小時(shí)或40 V轉(zhuǎn)移3小時(shí)。

(5) 膜的染色：

①轉(zhuǎn)移完成后，將膜用1×麗春紅染液染5分鐘，使用脫色搖床搖動(dòng)。

②用水沖洗去沒(méi)染上的染液，觀(guān)察膜上的蛋白。將膜晾干備用。

五、免疫反應(yīng)

(1) 封閉和初步洗膜：

①將轉(zhuǎn)膜用TBS（三倍體積）從底部向上浸濕。

②移至含有封閉液的平皿中，室溫下在脫色搖床上搖動(dòng)1小時(shí)。

(2) 一抗處理：

①將一抗用TBST稀釋至適當(dāng)濃度，準(zhǔn)備好在1.5 ml 離心管中。

②在實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上撕下適當(dāng)大小的保鮮膜，并用水浸濕四角，使其平整。

③將抗體溶液均勻涂抹在保鮮膜上。

④從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放在抗體液上。

⑤輕輕掀動(dòng)膜的四角以排出殘留氣泡。

⑥在室溫下孵育1～2小時(shí)后，用TBST在脫色搖床上洗兩次，每次10分鐘。

⑦再用TBS洗一次，10分鐘。

(3) 二抗處理和最終洗膜：

①用類(lèi)似的步驟準(zhǔn)備二抗稀釋液。

②將二抗溶液均勻涂抹在膜上，室溫下孵育1～2小時(shí)。

③用TBST在脫色搖床上洗兩次，每次10分鐘。

④再用TBS洗一次，10分鐘。

⑤進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

六. 化學(xué)發(fā)光，顯影，定影

(1) 混合試劑與膜接觸：

①在保鮮膜上等體積混合試劑A和B。

②等待1分鐘，將膜蛋白面朝下與混合液充分接觸。

③過(guò)1分鐘，將膜移到另一張保鮮膜上，去盡殘液，包好，并放入X-光片夾中。

(2) 顯影與定影：

①在暗室中，將1×顯影液和定影液分別加入塑料盤(pán)中。

②在紅燈下取出X-光片，使用切紙刀剪裁適當(dāng)大?。ū饶さ拈L(zhǎng)和寬均需大1 cm）。

③打開(kāi)X-光片夾，將X-光片放在膜上，一旦放上，不能移動(dòng)，關(guān)上X-光片夾，開(kāi)始計(jì)時(shí)。

④根據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱調(diào)整曝光時(shí)間，通常為1分鐘或5分鐘，也可選擇不同時(shí)間多次壓片，以達(dá)到較佳效果。

⑤曝光完成后，打開(kāi)X-光片夾，迅速浸入顯影液中顯影。待出現(xiàn)明顯條帶后，立即終止顯影。顯影時(shí)間一般為1～2分鐘（20～25℃）。溫度較低時(shí)需適當(dāng)延長(zhǎng)顯影時(shí)間。

⑥顯影結(jié)束后，將X-光片浸入定影液中，定影時(shí)間一般為5～10分鐘，以膠片透明為止。

⑦用自來(lái)水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。

注意事項(xiàng)：顯影和定影時(shí)移動(dòng)膠片時(shí)，盡量拿膠片一角，避免手指甲劃傷膠片，以免影響結(jié)果。

七、 凝膠圖象分析

使用凝膠圖像處理系統(tǒng)對(duì)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)的膠片進(jìn)行掃描或拍照，以進(jìn)行目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值的分析。

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