導(dǎo)語

細(xì)胞自噬（Autophagy）是細(xì)胞通過溶酶體降解受損細(xì)胞器或異常蛋白的“自我清理”機制，在癌癥、神經(jīng)退行性疾病等領(lǐng)域備受關(guān)注。然而，自噬檢測方法多樣且技術(shù)細(xì)節(jié)復(fù)雜，如何選擇并精準(zhǔn)解讀數(shù)據(jù)？本文系統(tǒng)梳理自噬研究的6大經(jīng)典實驗方法，助你避開實驗“雷區(qū)”，高效完成課題！

一、WesternBlot檢測LC3蛋白：自噬標(biāo)志物的“金標(biāo)準(zhǔn)”

原理：自噬過程中，胞漿型LC3-I會脂化形成膜結(jié)合型LC3-II，其比值（LC3-II/LC3-I）或LC3-II與內(nèi)參蛋白（如β-actin）的比值可反映自噬水平。

實驗步驟：

1.樣本處理：實驗組需設(shè)置自噬誘導(dǎo)劑（如雷帕霉素）和抑制劑（如氯喹CQ）對照。

2.蛋白提?。毫呀饧?xì)胞后離心取上清，BCA法定量。

3.電泳與轉(zhuǎn)膜：SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF膜。

4.抗體孵育：一抗（抗LC3抗體，如SigmaL7543），二抗（HRP標(biāo)記）。

5.顯影分析：化學(xué)發(fā)光法檢測條帶，計算LC3-II/LC3-I比值。

關(guān)鍵提示：

-溶酶體抑制劑必要性：氯喹可阻斷自噬體降解，通過比較“誘導(dǎo)組”和“誘導(dǎo)+抑制組”判斷自噬流（AutophagicFlux）是否完整。

-避免假陽性：某些應(yīng)激（如饑餓）會短暫上調(diào)LC3-II，需結(jié)合其他實驗交叉驗證。

二、熒光顯微鏡觀察：mRFP-GFP-LC3雙熒光探針法

原理：

-GFP：在酸性環(huán)境（溶酶體）中熒光淬滅；

-mRFP：耐酸性強，熒光穩(wěn)定。

當(dāng)自噬體（中性pH）形成時，顯示黃色斑點（GFP+mRFP疊加）；自噬體與溶酶體融合后，GFP信號消失，僅保留紅色斑點。

實驗步驟：

1.轉(zhuǎn)染/病毒感染：將mRFP-GFP-LC3質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞。

2.藥物處理：誘導(dǎo)或抑制自噬。

3.共聚焦顯微鏡觀察：統(tǒng)計紅黃斑點數(shù)量及比例。

結(jié)果判讀：

-黃斑（GFP+/mRFP+）：自噬體形成階段；

-紅斑（mRFP+/GFP-）：自噬溶酶體階段；

-紅斑增多：自噬流活躍。

優(yōu)勢：直觀區(qū)分自噬體與自噬溶酶體，動態(tài)監(jiān)測自噬流。

三、透射電鏡（TEM）：自噬結(jié)構(gòu)的“終極鑒定”

原理：透射電鏡可清晰觀察到自噬體（雙層膜結(jié)構(gòu)包裹細(xì)胞質(zhì)成分）及自噬溶酶體（單層膜包裹降解物質(zhì)）。

實驗流程：

1.樣本固定：2.5%戊二醛+1%鋨酸雙重固定。

2.脫水包埋：梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋。

3.超薄切片：切片厚度50-70nm，鈾鉛雙染色。

4.電鏡觀察：尋找典型自噬結(jié)構(gòu)并拍照記錄。

注意事項：

-自噬體結(jié)構(gòu)易與溶酶體或內(nèi)吞泡混淆，需結(jié)合其他實驗驗證；

-樣本制備耗時，成本較高。

四、流式細(xì)胞術(shù)：高通量檢測自噬活性

原理：利用熒光探針（如Cyto-ID）特異性標(biāo)記自噬體，通過流式細(xì)胞儀定量分析群體細(xì)胞自噬水平。

操作要點：

1.探針加載：Cyto-ID染料避光孵育細(xì)胞30分鐘。

2.洗滌與分析：PBS洗滌后上機檢測（Ex/Em=480/530nm）。

3.對照設(shè)置：陽性對照（雷帕霉素）、陰性對照（3-MA抑制劑）。

優(yōu)勢：快速、高通量，適合藥物篩選或大樣本分析。

五、溶酶體功能評估：自噬流的關(guān)鍵驗證

自噬體與溶酶體融合障礙會導(dǎo)致自噬流阻斷，需結(jié)合溶酶體活性檢測：

1.LysoTracker染色：

-原理：LysoTracker（如DND-99）靶向酸性細(xì)胞器（溶酶體）。

-步驟：1μMLysoTracker避光孵育30分鐘，熒光顯微鏡觀察紅色熒光強度。

-意義：溶酶體數(shù)量或活性降低可能提示自噬流受阻。

2.組織蛋白酶（Cathepsin）活性檢測：

-方法：使用熒光底物（如MagicRedCathepsinB試劑）檢測酶活性。

-結(jié)果：熒光強度降低表明溶酶體功能異常。

六、自噬相關(guān)基因/蛋白的分子調(diào)控

1.關(guān)鍵基因敲除/過表達：

-靶點：ATG5、ATG7、Beclin1等自噬核心基因。

-方法：CRISPR/Cas9、siRNA干擾或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。

2.信號通路檢測：

-mTOR通路：檢測p-mTOR（S2448）水平，mTOR抑制促進自噬。

-AMPK通路：p-AMPK（T172）激活可誘導(dǎo)自噬。

實驗設(shè)計避坑指南

1.自噬流檢測必不可少：單獨檢測LC3-II可能誤判，需結(jié)合抑制劑明確自噬活性。

2.多方法聯(lián)用：WesternBlot+熒光顯微鏡+電鏡組合提高結(jié)論可靠性。

3.關(guān)注細(xì)胞類型差異：不同細(xì)胞系基礎(chǔ)自噬水平差異大，需預(yù)實驗優(yōu)化條件。

結(jié)語

細(xì)胞自噬研究既是熱點也是難點，從方法選擇到數(shù)據(jù)解讀均需嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計。皮諾飛生物提供自噬研究全方案支持，包括：

-LC3/ATG抗體：高特異性，低背景；

-自噬誘導(dǎo)/抑制劑：氯喹、雷帕霉素等現(xiàn)貨供應(yīng)；

-一站式檢測服務(wù)：電鏡切片、流式分析、熒光染色。

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