第一節(jié) FISH技術(shù)的基本原理及優(yōu)勢

熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)是近些年較為常用的分子細胞遺傳學(xué)技術(shù)、該技術(shù)通過已知的核苷酸片段與靶DNA形成靶DNA與核酸探針的雜交體，可直接在組織切片(冷凍切片或石蠟切片)、細胞涂片、染色體制備標本或培養(yǎng)細胞爬片上雜交。該技術(shù)操作簡單、快速、直觀、靈敏度高，目前廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究及某些遺傳疾病和腫瘤的臨床診斷。

一、原理

FISH是以熒光素標記已知序列的核苷酸片段(探針)與熒光素標記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測體系在顯微鏡下對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。具有敏感、快速、能同時顯示多種顏色等優(yōu)點，不但能顯示中期核分裂象的染色體，還能檢測間期細胞核的DNA。

二、優(yōu)勢

自20世紀80年代末，Pinkel和Heiles將FISH技術(shù)引入染色體檢測領(lǐng)域后，F(xiàn)ISH技術(shù)就在臨床診斷及科研工作中得到了廣泛的運用，顯示出與一些傳統(tǒng)技術(shù)相比的明顯優(yōu)勢。與傳統(tǒng)的免疫組織化學(xué)法(IHC)相比，FISH技術(shù)具有良好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。此外，熒光原位雜交結(jié)果的判定借助于對熒光的顏色判斷和信號計數(shù)，客觀地量化了檢測結(jié)果。FISH的另一個特點是可以聯(lián)合應(yīng)用多種標記系統(tǒng)，在一次雜交中可檢測多種探針在染色體上的位置及探針間的相互關(guān)系，即多色FISH或多靶FISH。與其他分子生物學(xué)檢測手段相比，F(xiàn)ISH可以在組織和細胞結(jié)構(gòu)相對完整的前提下，在癌細胞原位分析單細胞核內(nèi)基因的變化，同時又排除了其他非癌細胞的干擾，所以已廣泛應(yīng)用于腫瘤研究中的基因擴增、易位重排及缺失等的檢測，在腫瘤診斷和鑒別診斷、預(yù)后和治療監(jiān)控等方面都有重要意義。

第二節(jié) 熒光原位雜交的實驗操作

一、探針標記

FISH探針一般采用隨機引物法或切口翻譯法，如將PCR技術(shù)引入FISH探針標記，可使其靈敏度提高到0.25kb。應(yīng)用TSA系統(tǒng)(tyramidesignalamplification)能將雜交信號再放大1000倍，可用于單拷貝基因的定位。FISH分辨率大約為1~3Mb,如果應(yīng)用強變性劑處理染色體，讓DNA分子從蛋白質(zhì)中分離出來，使雙DNA完全伸展并黏附在玻片上，經(jīng)預(yù)處理后，分辨率可達1~2kb。還可采用對分裂中期染色體進行顯微解剖(microdissect)法以提高分辨率。

探針的熒光素標記可以采用直接和間接標記的方法。間接標記是采用生物素標記DNA探針，雜交之后用耦聯(lián)有熒光素親和素或鏈霉親和素進行檢測，同時利用親和素-生物素-熒光素復(fù)合物，將熒光信號放大，從而可以檢測500bP的片段。直接標記法是將熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價結(jié)合，或在缺口平移法標記探針時將熒光素核苷三磷酸摻入。

由于間接法的操作步驟較為繁瑣，所以目前直接法的使用更為廣泛。

二、實驗相關(guān)設(shè)備

1.熒光原位雜交成像系統(tǒng)(圖20-2-1),包括熒光顯微鏡及相應(yīng)的濾光片組、分析軟件。 

2.42℃恒溫孵箱或雜交儀(圖20-2-2),立式染缸(考普林瓶)、計時器、水銀溫度計。

3.恒溫水浴箱、旋渦混合器、離心機、烤片機、移液器。

4.pH計或精密pH試紙、載玻片、蓋玻片、0.5ml離心管。

圖20-2-1熒光原位雜交成像系統(tǒng)     圖20-2-2雜交儀

三、實驗操作

熒光原位雜交技術(shù)總體上分為：預(yù)處理階段，變性雜交階段，玻片后洗階段，復(fù)染階段，鏡檢結(jié)果階段。檢測試劑盒應(yīng)該使用國家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)認可的產(chǎn)品。

不同公司生產(chǎn)的探針試驗方法略有不同，由于采用不同的探針試劑，診斷技術(shù)操作方法會有差異，所以本文以Her-2探針為例，講解其實驗步驟，各實驗室要開展熒光原位雜交技術(shù)應(yīng)結(jié)合說明書進行操作，現(xiàn)介紹兩種操作方法：

(一)操作步驟(以金菩佳試劑盒為例)

1.組織預(yù)處理

(1)組織經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片4~5μm,置于防脫載玻片上。

(2)將組織切片置于65℃烤箱內(nèi)過夜。

(3)切片脫蠟至蒸餾水。

(4)30%酸性亞硫酸鈉(sodiumbisulfite)50℃處理組織切片20～30min;或用90℃去離子7理組織切片20~30min。

(5)室溫下于2×SSC溶液中漂洗2次，每次5min。若用90℃去離子水則省略此步驟。

(6)切片浸泡在蛋白酶K工作液(終濃度200μg/ml)中，37℃孵育5~30min。

(7)切片經(jīng)蛋白酶K消化后，于2×SSC溶液中漂洗2次，每次5min。

(8)室溫下將切片依次置于70%乙醇、85%乙醇和無水乙醇中各2min脫水。

(9)自然干燥切片。

2.變性雜交

(1)熒光原位雜交有雜交儀變性雜交和甲酰胺變性雜交兩種方法。前者是用雜交儀對樣本和探針進行共變性，減少人為因素的影響；后者是樣本和探針分別進行變性。

(2)雜交儀變性雜交(自動操作):設(shè)置雜交儀器共變性條件：83℃5min,雜交條件：42℃,16~18h(不同公司探針請參考說明書)。

將探針(2.0μl)、雜交緩沖液(7.0μl)和去離子水(1.0μl)加入EP管(依據(jù)試劑說明書推薦使用),渦旋混勻后短暫離心1~3s,滴加于切片雜交區(qū)域，加蓋蓋玻片，用橡皮膠封邊，避免產(chǎn)生氣泡。放入雜交儀中雜交。

3.雜交后洗滌

(1)將切片置于室溫50%甲酰胺/2×SSC溶液中移去蓋玻片。

(2)將切片置于(46±1)℃50%甲酰胺/2×SSC溶液中，漂洗5min×3次。

(3)將切片置于(46±1)℃2×SSC溶液漂洗4min。

(4)將切片置于(46±1)℃0.1%NP-40/2×SSC中，漂洗5min。

(5)將切片置于2×SSC5s后迅速將其置于70%乙醇中，漂洗3min。

4.復(fù)染暗處自然干燥切片后，將15μlDAPI復(fù)染劑滴加于雜交區(qū)域，立即蓋上蓋玻片。放置10~20min后，在熒光顯微鏡下選用合適的濾光片組觀察切片。

(二)操作步驟二：

現(xiàn)介紹Abbott公司的PathvysionHer-2DNAProbeKit的操作方法，預(yù)處理的試劑盒為Abbott公司的VysisPareffinPretreatmentReagentkit。

1.組織雜交前處理

(1)組織經(jīng)10%中性福爾馬林固定包埋，切片4~5μm,置于防脫載玻片上烤片60℃過夜。

(2)切片脫蠟至蒸餾水。

(3)預(yù)處理液(pretreatmentsolusion)80℃處理切片10min后蒸餾水洗3min,室溫空氣中干燥2~5min。

(4)放入37℃水浴預(yù)熱的消化液(proteasebuffer+pepsion)中孵育10~60min后蒸餾水洗3min,室溫空氣中干燥2~5min。

(5)將切片梯度脫水，空氣中干燥。

2.變性雜交加適量探針于組織上蓋玻片封片，用橡皮膠封片放入雜交儀中雜交過夜。設(shè)置雜交儀器共變性條件：75℃5min,雜交條件：37℃,16~18h。

3.雜交后洗滌

(1)從雜交儀中取出昨日玻片，去掉封片膠。

(2)準備兩缸washbuffer備用，在第一缸洗脫液(washbuffer)中去掉蓋玻片。

(3)74℃水浴預(yù)熱的第二缸洗脫液(washbuffer)中漂洗2min。

(4)空氣中干燥。

4.復(fù)染加適量DAPI復(fù)染劑于雜交區(qū)域，蓋上蓋玻片，置于熒光顯微鏡下觀察。

四、鏡檢結(jié)果

熒光顯微鏡觀察，通過專用軟件合成彩色圖像，攝影保存FISH結(jié)果，進行結(jié)果判定(圖20-2-3~20-2-6):

隨機計數(shù)20個細胞，統(tǒng)計Ratio值(Ratio值=20個細胞核中紅信號總數(shù)/20個細胞核中綠色信號總數(shù)):

Ratio<1.8為陰性結(jié)果，提示樣本無Her-2基因擴增。

Ratio>2.2為陽性結(jié)果，提示樣本存在Her-2基因擴增。

Ratio介于1.8~2.2之間時為臨界值，可增加計數(shù)細胞至60～100個，或重做FISH實驗來判斷最終結(jié)果。

計數(shù)細胞必須是各通道信號均清晰可辨的細胞，細胞核輪廓不清或有重疊的不要分析。

雜交不均勻的區(qū)域不要分析。

背景深影響信號判斷的區(qū)域不要分析。

在分析石蠟切片時，分析的區(qū)域應(yīng)在腫瘤細胞集中的部位(需由病理科醫(yī)師認定)。

如果超過25%的細胞核內(nèi)信號太弱，則該區(qū)域不要進行分析。

如果超過10%的細胞質(zhì)內(nèi)有信號，則該區(qū)域不要進行分析

五、FISH檢測操作注意事項

1.組織處理須標準化，應(yīng)盡可能縮短取材到固定的時間。在觀察完大體標本特征后，將組織每隔5~10mm呈書頁狀切開充分固定，組織固定液為10%中性福爾馬林緩沖液，最佳固定時間6~48h。有的公司探針超過6周的石蠟切片不宜再用于Her-2檢測，有的公司探針對幾年或幾十年的蠟塊仍可用于Her-2檢測。

2.實驗程序必須標準化。任何檢測結(jié)果的偏差均需報告，并重新進行確認調(diào)整。

3.實驗室在每一輪檢測中均應(yīng)使用標準化對照材料(陽性、陰性)。

4.切片在后洗液中應(yīng)嚴格掌握溫度和時間，可降低背景。

5.雜交后的玻片應(yīng)注意避光，盡量不要暴露于日光燈和陽光下，存放于避光玻片盒內(nèi)。根據(jù)熒光染料的不同，選擇相應(yīng)的熒光顯微鏡濾色片。

6.熒光信號容易淬滅，染色后應(yīng)及時在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，同時攝影保存圖像。如果當時不觀察，可將切片放入-20℃避光的盒內(nèi)保存，兩個月或更長時間仍可保持良好。

7.試劑不宜反復(fù)凍融。

8.探針使用前應(yīng)先混勻后離心，注意避光。

9.報告Her-2結(jié)果的醫(yī)生應(yīng)相對固定。

10.在乳腺癌Her-2結(jié)果判斷時，應(yīng)選擇浸潤性病變部位。

11.在進行細胞計數(shù)信號時，應(yīng)至少2個人隨機判讀腫瘤細胞信號，至少計數(shù)20個細胞。